体外受精实验室设置要求

编辑:薄荷绿℡ 2019-07-25 12:24:27

作者:韩树标,黄国宁,重庆市妇产科医院


体外受精(IVF)实验室的主要功能是进行人类配子、胚胎的体外操作和培养,如卵子的捡取与筛选,配子的常规体外受精和卵胞浆内单精子显微注射、受精的判断、胚胎的体外培养和评估、胚胎移植及冷冻保存等。在人类体内,配子、胚胎一直处于无光照、恒温、恒湿的稳定的生长环境,同时也处于母体的保护下生长发育。但是在IVF实验室,目前尚无法完全模拟体内环境。而早期人类配子、胚胎自身不具备任何屏障和保护功能,对体外环境十分敏感,IVF实验室的环境如空气质量、温度、湿度、光照以及仪器设备等都会影响胚胎发育潜能和临床结局,也有可能影响胎儿安全性。因此,IVF实验室设置尤其是安全设置就变得尤为重要。


1 IVF实验室空气质量设置


空气质量是实验室内影响胚胎质量的主要因素。实验室空气中的有害物质主要是挥发性有机物(VOCs),如甲醛、苯、甲苯、二甲苯及二氧化氮等。VOCs可能会影响胚胎DNA而终止胚胎发育,VOCs浓度也与人类精子DNA碎片比例呈正相关关系。Boone等研究表明,改善IVF实验室空气质量,可以提高可移植胚胎率。Khoudja等通过采用在实验室空气净化系统加装VOCs过滤装置,降低实验室内空气中VOCs的含量,结果表明,空气中VOCs含量降低后,受精率、卵裂率、囊胚形成率、临床妊娠率以及胚胎种植率都显著提高。小鼠和人类胚胎实验表明,空气中VOCs浓度超过1.29mg/m3会直接对胚胎产生毒性,VOCs浓度在0.645mg/m3左右时,虽然不影响囊胚的形成率和临床妊娠率,但会显著增加流产率。
影响IVF实验室内空气质量的主要因素除了外界环境以外,IVF实验室的装修情况也是影响空气质量的主要原因之一,如装饰所用的地板胶、密封剂、黏合剂等建筑材料都会释放VOCs;此外,油漆以及涂料等也会释放VOCs。因此,不建议使用油漆等含甲醛、乙醛、活性胺等涂料,必须使用的黏合剂和密封剂也建议使用硅胶类制品代替。此外,IVF实验室使用的各种清洁产品、显微镜、显示器、电脑以及实验器具等,也会释放VOCs到实验室空气中。


因此,IVF实验室设置时,在安装层流系统对空气进行净化的同时,建议加装VOCs 过滤系统以尽可能地去除外界空气中的VOCs对胚胎发育的影响。针对室内装饰以及器具所释放的VOCs,建议将IVF工作站的进风口直接与IVF实验室层流系统相连接,直接使用经过层流系统过滤后的外界空气,而不是在室内循环后的空气,并在进风口安装VOCs过滤系统进一步过滤空气中的VOCs;条件允许的情况下,建议在二氧化碳培养箱进气口也加装VOCs过滤系统,以尽可能减小室内VOCs对胚胎发育的影响。


2 IVF实验室温、湿度设置


配子、胚胎受精及生长发育所需的各种蛋白质、酶以及细胞骨架等都需要一定的温度才可以维持其三维结构,以便于发挥功能。人的基础体温是37℃,因此,人类卵子和胚胎的最适生长和发育温度也应保持在37℃。然而在实际操作过程中很难保持37℃的恒温环境,低于37℃的环境温度除了降低卵子内的代谢外,主要影响纺锤体的形态。1990年研究发现,卵子在低于37℃的环境中转移时,卵子的纺锤体会变小,甚至组成纺锤体的微管解聚直至消失。成熟卵子于33℃下,纺锤体5min内开始解聚,10min就会完全消失。虽然目前关于温度对其他细胞器的影响尚缺乏研究,但是不可否认的是也会影响其他细胞器和结构,这也可能是低温导致受精率和着床率降低的原因。


一般认为,温度升高,微观的聚合也会增加,因而纺锤体的结构也会更稳定。目前的研究表明,轻微的温度升高会增加更多的微管形成纺锤体,但更高的温度却会破坏纺锤体,且这种破环是不可逆的;动物实验也表明,温度过高会抑制细胞分裂并导致胚胎死亡。


湿度对卵子、胚胎的影响是间接的,它主要是通过影响培养液中各种成分的浓度以及渗透压来间接地影响卵子、胚胎的发育。在室内湿度较低或是开放式培养体系中,因培养基的挥发而改变培养基的渗透压的现象是很常见的。为了防止水分的挥发,目前的培养系统大多数都选用矿物油或石蜡油覆盖培养液预防蒸发,保障培养液的渗透压和各种成分浓度的恒定,减小pH的急剧波动。建议将实验室的相对湿度控制在40%~60%。湿度过高的情况下,设备容易锈蚀、微生物生长,工作人员的舒适感下降,不利于实验室环境的控制;相反,过低湿度的环境下,容易产生静电,培养基渗透压易受到影响。


综上,温度是影响卵子以及胚胎质量的诸多因素中最重要的一个。稍低的温度也许短时间不会有太大影响,但过高的温度将会不可逆地改变卵子的功能。因此,IVF实验室要设置一个比较恒定的温度范围,并且每天对所有的加热装置,如培养箱、显微镜热台和热板等进行温度校准,特别是不能超过37℃。实验室温度在20~25℃,相对湿度在30%~60%。


3 IVF实验室光照设置


配子、胚胎在体内都是生长在无光照的环境中,而体外操作过程不可避免地会使配子、胚胎暴露于光照下。自20世纪70年代开始就有关于可见光可能对动物或者人类早期胚胎发育造成不良影响的报道。2007年韩国学者研究表明,高光照强度会显著降低豚鼠的囊胚形成率;此外,显微镜光源也会影响胚胎的发育潜能。因此,应尽可能减少配子、胚胎暴露于显微镜下的观察时间。


4 IVF实验室仪器设置


IVF实验室仪器设备是开展治疗的基本保障。主要仪器设备有:培养箱、超净工作台、显微操作仪、显微镜、激光破膜仪、液氮罐、冰箱、热板等。仪器的配置不仅要依据工作量,还要考虑重要仪器的质量参数以及性能等可能会对配子、胚胎所产生影响,建议尽量购买专门用于IVF实验室的仪器设备。某些重要仪器,如显微操作仪、激光破膜仪等,应考虑备用品,以保证突发故障时正常工作不受到影响。
4.1 二氧化碳培养箱 二氧化碳培养箱是IVF实验室最为关键的仪器之一,主要维持配子、胚胎体外生长的酸碱度、温度及相对湿度,有人把二氧化碳培养箱比作IVF实验室的“心脏”。用于人类体外胚胎培养的二氧化碳培养箱按加热结构不同分为气套式加热和水套式培养箱;按培养时气体成分控制不同又可分为高氧(20%)、低氧(5%)培养箱。目前的研究表明,胚胎低氧环境(5%)培养,可最大程度降低电子脱轨产生的氧自由基,维持胚胎发育潜能及胚胎活性;高氧环境(20%)培养,则可能造成胚胎DNA碎片增加、基因表达改变、细胞功能受损,导致胚胎发育迟缓、碎片增加以及凋亡或流产等。此外,不同体积的二氧化碳培养箱开关门后,其温、湿度和二氧化碳浓度的恢复时间也不尽相同,在条件允许的情况下,建议每例患者的胚胎单独放置于一个培养箱内,以避免培养箱开关门时影响其他胚胎发育。最后,还需要注意的是,要尽可能避免将二氧化碳培养箱安装在垂直于实验室层流进风口的位置,以减少开关门时箱体内温、湿度以及二氧化碳浓度的流失,缩短其恢复时间。


4.2 超净工作台 虽然配子、胚胎体外发育主要是在培养箱内完成的,但其所有操作,如授精、胚胎评估、辅助孵化、胚胎冷冻与复苏等,都是在超净工作台内进行的。因此,超净工作台的质量以及参数也会对配子、胚胎体外发育有着一定的影响。超净工作台主要组成部分有:滤器(高效过滤器、初效过滤器)、风机、电气控制及排气通道等。主要通过风机将空气吸入预过滤器,经由静压箱进入高效过滤器过滤,将过滤后的空气以垂直或水平气流的状态送出,使操作区域达到百级洁净度。


4.3 激光破膜仪 IVF实验室中激光破膜仪的主要作用是对配子、胚胎透明带进行打孔或者消融。在进行植入前遗传学诊断以及筛查,排除携带遗传性疾病以及染色体异常的胚胎时,首先的工作就是通过显微操作技术活检胚胎卵裂球或者囊胚滋养层细胞,然后通过全基因组扩增以及高通量基因测序技术,确认胚胎是否已携带遗传性疾病的致病基因以及染色体正常与否,并作为移植与否的标准;胚胎在体外培养或冷冻保存解冻后,可能会导致胚胎透明带变厚、硬化,而不利于移植后胚胎的种植,导致种植率下降。因此,需要对这部分胚胎进行透明带的消融,以降低透明带厚度,提高胚胎种植率。
上述技术都要求激光的精准度高,可以尽可能地不影响透明带以外的其他细胞器,尤其是胚胎卵裂球以及囊胚内细胞团,同时激光的位置也要可以灵活调整,以便于进行多位置打孔或者消融时可以快捷操作,尽量缩短操作时间。


参考文献略。


来源:韩树标,黄国宁,体外受精实验室设置要求 [J].中国实用妇科与产科杂志,2018,34(6):583-586。

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